Förändring av den molekylära specificiteten av antinukleolära antikroppar vid induktion och regress av autoimmun sjukdom | Application
Förändring av den molekylära specificiteten av antinukleolära antikroppar vid induktion och regress av autoimmun sjukdom
Registration number: LIO-40771
Ansökan om Stipendier för forskningsförberedande utbildning
Application started by: Anna Holm, 2008-12-21
Professional title at the time of application: Med kand
Work place at the time of application: Mol. immunol. patologi (AIR)
Last updated / corrected by: Agneta Linghag, 2009-09-02
Application received by: Region Östergötland
Granted and completedGranted and completed
Applicant: Anna Holm
Med kand, Mol. immunol. patologi (AIR)

Utbildningsplan

Ämnesområde

Mikrobiologi, immunologi och infektionssjukdomar

Sammanfattning

Bakgrund
Antikroppar riktade mot kroppsegna strukturer är den dominerande sjukdomsmekanismen vid systemiska autoimmuna sjukdomar, och uppfattas idag vara antigen-drivna. Vid systemiska autoimmuna sjukdomar är de cellulära autoantigenerna ofta en kombination av nukleinsyror (DNA eller RNA) och proteiner, samlade i makromolekylära komplex. I nukleolerna finns s.k. small nucleolar ribonucleoprotein particles (snoRNPs), stabila strängar av RNA till vilka ett antal proteiner är bundna.

Kvicksilver (Hg) inducerar i möss med vissa MHC klass II haplotyper (H-2s) en systemisk autoimmun reaktion karakteriserad av autoantikroppar mot ett 34-kDa U3-snoRNP protein, fibrillarin. Fibrillarin är också det dominerande autoantigenet hos 10-20% av patienter med den reumatiska sjukdomen systemisk sklerodermi.

Tidigare egna studier inom området
Under det fördjupningsarbete som utfördes hos den aktuella forskargruppen vårterminen 2008 påvisades att MHC klass II gener (H-2) och gener utanför H-2 spelar stor roll för utveckling av autoantikroppar mot fler, men delvis oidentifierade, nukleolära målproteiner med 45, 60-65, och 70-100 kDa molekylvikt, utöver det tidigare kända 34-kDa fibrillarin.

Det aktuella projektets frågeställningar
1. När, i vilken ordning och med hur stor homogenitet utvecklas de 4 olika antinukleolära antikroppsspecificiteter som iakttagits under 8 veckors Hg-behandling?
2. Mot vilka proteiner är autoantikropparna riktade förutom fibrillarin? Kandidatprotein för 90-100 kDa proteinet är M-Phase Phosphoprotein (MPP) om 70-110 kDa.
3. I vilken ordning sker utsläckningen av de antinukleolära antikroppsspecificiteterna när autoimmunt stimulus (Hg-behandling) upphör?

Hitintills erhållna resultat inom projektet
Efter genomfört fördjupningsprojekt har jag arbetat med detta projektet sedan sommaren 2008. Försök med regelbunden blodprovstagning upp till 8 veckors Hg-behandling och upp till 22 veckors avklingning har genomförts.

Hitintills har alla prover (totalt 185) från detta försök screenats avseende förekomst av antinukleära/antinukleolära antikroppar (ANA/ANoA).

Under stipendietiden sommaren 2009 skall följande genomföras
1. Resterande ANA/ANoA-titreringar och immunoblotting av de 185 sera.
2. Med immunoprecipitationsteknik påvisa specificiteten för det 70-110 kDa nukleolära protein som iakttagits vid immunoblotting. Den primära hypotesen är att det utgörs av M-Phase Phosphoprotein, MPP.
3. Påbörja sammanställning av resultaten till ett manuskript.

Betydelse av projektet
Uppkomstmekanismerna för autoantikroppar vid systemiska autoimmuna sjukdomar är väsentligen okända. Den nu aktuella modellen ger möjlighet att studera hur den molekylära specificiteten utvecklas i den tidiga induktionsfasen, och hur den förändras när autoimmunt stimulus (Hg-behandlingen) klingar av. Dessa resultat förväntas ge generaliserbara kunskaper om den molekylära patogenesen vid systemiska autoimmuna sjukdomar.

Handledare

Supervisor

Per Hultman
Professor/överläkare, Närsjukvården i Centrala Östergötland

Äskande om stipendiemedel

Sökanden kommer under stipendietiden erhålla annan ersättning från Landstinget i Östergötland

not checked Ja
checked Nej

Stipendieperiod

 Start datumSlut datum
Period 18 juni 20092 augusti 2009
Period 2  
Period 3  
Period 4  
DescriptionShort description of the costSum
Äskade medel8 veckor24 000
Sum 24 000

Populärvetenskaplig rapport (lämnas senast en månad efter stipendietidens slut)

Resultat

Alla serum screenades avseende ANA/ANoA och ANoA-positiva serum titrerades. Observerat ANoA-mönster är det clumpy pattern som setts tidigare då H-2s möss exponerats för Hg el Ag, samt i vår förra studie på H-2q möss. Inga kontroller utvecklade ANoA under/efter behandlingen. Efter 2 v var alla Hg-exponerade positiva för ANoA, medelvärde för reciprok titer var 520. Efter 3 v och framåt nåddes en platå med maxvärde vid 8 v på 8777. 10 v efter avslutad behandling sågs en signifikant sänkning av medelvärdet (p <0,05). Jmf med prover tagna vid 2 v visade prover efter 3, 4, 6 och 8 v, samt 10 v efter avslut signifikant skillnad (p <0,001) för alla tidpunkter. För Ag sågs en långsammare utveckling av ANoA jmf med Hg. Signifikant skillnad sågs efter 6 v (p <0,01), medelvärde 820. Jmf med värdet vid 2 v sågs signifikant skillnad efter 6 (p <0,05) och 8 v, samt 10 resp 22 v efter avslut (p <0,01). Hg gav ett starkare svar än Ag efter 2 v (p <0,001). Skillnaden var signifikant även efter 3, 4 (p <0,001), 6 och 8 v behandling, samt 10 v efter avslut (p <0,01).

Alla serum analyserades med immunoblot. Autoantikroppar (aAk) gav upphov till band vilka tilldelades en molekylvikt. Fem storlekar (34, 45, 50, 70 och 110 kDa), vilka liknar profilen för MPP10, valdes ut för utvärdering. Inga kontroller visade band på 34, 45 el. 110 kDa, däremot hade alla från början band på 50 kDa. Mellan 1-4 v utvecklades aAk mot 70 kDa. I Hg-gruppen sågs alla utvärderade band, och vi såg en tendens till systematisk utveckling av aAk. 45 kDa noterades efter ca 1-2 v, därefter 70 kDa vid 2-3 v. Mellan 2-4 v sågs utveckling av 34 kDa och sist, efter 3-4 v, 110 kDa. Vid 3 v var signifikant fler Hg-exponerade positiva för 34 kDa jmf med innan behandling, kontroller och Ag. Efter 6 v var 100 % av Hg-mössen positiva för 34 kDa. För 45 kDa sågs efter 2 v signifikant skillnad jmf med innan behandling och kontroller då 70% i Hg-gruppen var positiva. Statistisk signifikans sågs vid jmf mot Ag-möss efter 4, 6 och 8 v. Innan behandling fanns 50 kDa hos alla Hg-djur. Vid 1, 2 och 3 v sjunker antalet positiva djur signifikant. I Hg-gruppen skiljde sig 70 kDa signifikant innan behandling jmf med efter 2 v. Efter 3 v fanns 70 kDa hos 80% och signifikant skillnad sågs jmf med Ag-behandling. För 110 kDa fanns efter 3 v signifikant skillnad jmf med prover innan behandling, kontroller och Ag då 60% av Hg-mössen var positiva. Hos Ag-behandlade sågs band på 45 och 110 kDa. Signifikanta skillnader inom gruppen fanns endast för 45 kDa. Vid jmf mot kontroller sågs signifikanta skillnader endast för 70 kDa och då pga att fler kontroller var positiva.

Tre försök med immunoprecipitation (IP) gjordes, varav de två första inte gav förväntat resultat. Problemet antogs vara icke intakt cDNA. Gelfärgning av Western C Standard samt translationsprodukter av MPP10 och NOR-90 visade translaterade proteiner i alla batcher. Vid det tredje försöket användes nya Protein A-kulor, men resultat föreligger ännu inte.

Diskussion

Precis som tidigare studier av HgIA visade vår aktuella studie att Hg inducerar ANoA och autoantikroppar (aAk) vid immunoblot starkare än Ag. ANoA och immunoblot korrelerade så till vida att ANoA-mönster detekterades vid samma tidpunkt (2 v) som proteinband på immunoblot. I denna studie observerade vi även ett minskat immunsvar när den inducerande substansen eliminerats. Störst skillnader sågs i alla avseenden mellan kontroller och Hg-exponerade möss.

Vi såg en utveckling av flera aAk, detekterade som proteinband av olika storlekar vid immunoblot. Dessa överensstämmer med band detekterade i vår förra studie. 34 kDa kan utgöras av fibrillarin som är väl studerat vid HgIA. Det skulle även kunna utgöras av Imp4, ett 34 kDa stort protein som interagerar med MPP10. Vi observerade, liksom i förra studien, band på 45 kDa. Innan den förra studien har detta inte beskrivits för FVB vid HgIA. 50 kDa observerades hos de flesta av mössen, och 70 kDa verkar utgöras av det band som vi tidigare beskrev som 60-65 kDa. Orsaken till skillnaden i storlek är oklart; en ny molekylviktsmarkör har använts, men i övrigt är analyserna utförda som tidigare. Bandet benämnt 110 kDa stämmer väl överens med tidigare observationer (Martinsson, K. et al; Holm, A. et al, opubl).

Ett syfte med detta projekt var att ev. kunna påvisa s.k. epitop spreading. Epitop spreading innebär att ett initierande antigen, t.ex. ett protein i ett proteinkomplex, ger upphov till en aAk och att immunsvaret sedan ”breddas” och sprids till andra antigener inom samma komplex. Denna spridning kan ske intra- och/el. intermolekylärt (Farris et al, 2000; Monneaux & Muller, 2001). I denna studie ser man en breddning av aAk-svaret, vilket skulle kunna bero på epitop spreading. Det som tyder på att detta sker i FVB vid exponering för framför allt Hg, men till viss del även för Ag, är att fibrillarin återfinns i samma proteinkomplex, U3 snoRNP, som MPP10. Dessutom finns i detta komplex proteiner vars storlekar överensstämmer med de band vi sett vid immunoblot. Vi kan dock inte visa att denna spridning sker i en viss ordning/bestämd sekvens. Då spreading är beroende av presentation och processning av antigener (Monneaux & Muller, 2001) talar detta för att spridningen inte behöver ske i en viss ordning – det antigen som presenteras och processas först är även det som det bildas Ak mot först. Sannolikheten att detta skulle ske i exakt samma sekvens i alla individer är förmodligen liten. En specifik struktur har man tidigare endast sett i modeller för SLE (peptidinducerad lupus) och MS (EAE) (James & Harley, 1998, Farris et al., 2000).

Fortsatt skulle det vara intressant att slutföra och utföra ytterligare IP för att se om det är MPP10 som Ak riktar sig mot, att exponera mössen för Hg under en väsentligt kortare tid och sedan analysera hur minskningen av svaret vid olika tidpunkter ser ut, samt att reinducera djuren efter en tid för att se om det finns skillnader i ett primärt resp sekundärt immunsvar.

Decision

Decision date: 2009-03-18

Brief description of each costApplied sumDecision SEKDecision comment
Äskade medel
8 veckor24 00024 000 
sum24 00024 000 

Förändring av den molekylära specificiteten av antinukleolära antikroppar vid induktion och regress av autoimmun sjukdom | Application, from Region Östergötland
http://researchweb.org/is/en/lio/ansokan/40771