Kartläggning av immunreglerande effekter efter B-cellsdepletion med rituximab vid ANCA-positiv vaskulit. | Application
Kartläggning av immunreglerande effekter efter B-cellsdepletion med rituximab vid ANCA-positiv vaskulit.
Registration number: LIO-51261
Kliniskt forskningsprojekt för ST-läkare vid Landstinget i Östergötland
Application started by: Sofia Nyström, 2009-03-30
Professional title at the time of application: Läkare
Work place at the time of application: Klinisk immunologi och transfusionsmedicin
Last updated / corrected by: Sofia Nyström, 2011-03-10
Application received by: Region Östergötland
Granted and completedGranted and completed
Applicant: Sofia Nyström
Överläkare, Klinisk immunologi och transfusionsmedicin

Information

Ämnesområde

Mikrobiologi, immunologi och infektionssjukdomar

Sammanfattning av projektet

Bakgrund
Småkärlsvaskulit är en systemsjukdom som beror på inflammation i kroppens kärl. Alla organ i kroppen kan drabbas. Vanligast är engagemang av njurar och respirationsorgan. Sjukdomen är autoimmun och karaktäriseras av förekomst av en speciell typ autoantikroppar, ANCA. Vad som underhåller inflammationen i kärlväggen är inte klarlagt men defekt reglering av B- och T-lymfocyter bedöms vara av central betydelse. Sjukdomen behandlas vanligen med cyklofosfamid. En ny lovande behandlingsprincip är B-cells depletion med det biologiska läkemedlet rituximab. Vid ett immunsvar mognar B-celler ut till antikroppsproducerande plasmaceller. Den initiala hypotesen var att de gynnsamma effekterna av rituximab framförallt skulle bero på minskade nivåer autoantikroppar (ANCA). Att ANCA nivåerna är fortsatt förhöjda trots klinisk förbättring hos patienterna talar dock för att B-cellernas roll i sjukdomsprocessen inte är begränsad till antikroppsproduktion, utan är mer komplex. Det är numera vedertaget att det finns undergrupper bland B-celler som har reglerande och antigenpresenterande funktioner och således kan initiera ett immunsvar genom att stimulera T-celler. Det har också visats att B-cells depletion med rituximab också påverkar T-cellerna genom att öka mängden reglerande T-celler. En potentiellt immunreglerande B-cellspopulation, där avvikelser påvisats vid RA och SLE, uttrycker CD25 (IL-2alfa receptor).

Frågeställning
Projektets övergripande mål är att öka kunskapen om cirkulerande B- och T-cells populationer vid småkärlsvaskulit. Förekommer brister i immunreglering som korrigeras vid behandling med rituximab? Går det att identifiera markörer för prognos, sjukdomsaktivitet och val av behandling?

Metod
16 friska kontrollpersoner, 19 patienter med aktiv vaskulitsjukdom och 16 patienter med vaskulitsjukdom i remission har lämnat prover. Provinsamling var 3:e månad under 18 månader pågår hos 10 patienter som fått rituximab, och är snart klar. Lymfocyter från perifert blod samt plasma från alla provtillfällen finns nedfrysta för ytterligare analyser och funktionella tester.
Flödescytometri med 6-färgsteknik
6-färgsflödescytometri används för analys av ett stort antal relevanta markörer för olika undergrupper av B- och T-lymfocyter med fokus på immunreglering.
Stimulering av B-celler
1.Metoduppsättning: B-celler, CD19+ lymfocyter, isoleras fram ur perifert blod från kontrollpersoner med BD FACSAria cell-sorting system. B-celler stimuleras med olika typer av antigen och odlas sedan under sedvanliga betingelser i fyra dygn. B-cells proliferation/aktivering bedömes avseende blastförekomst och ett ökat uttryck av CD80/86 med en etablerad flödescytometrisk metod. Medium tas tillvara och analyseras avseende förekomst av secernerade immunglobuliner och cytokiner med ELISA och Luminex teknik. Sedan kan i detta system effekten av plasma från patienter i aktiv sjukdom respektive remission samt kontroller studeras för att utröna ifall det finns någon cirkulerande faktor som påverkar B-cellernas funktionalitet.
2.I steg 2 delas B-celler från såväl patienter med aktiv vaskulitsjukdom, vaskulitsjukdom i remission som friska kontroller upp i två undergrupper CD19+/CD25+ samt CD19+/CD25-. Celler och odlingsmedium analyseras enligt punkt 1 och resultaten jämförs. Vidare testas de båda B-cellspopulationerna avseende förmåga att aktivera T-celler i ett etablerat system där naiva T-celler aktiveras med anti-CD3, men utan co-stimulering, med efterföljande mätning av cytokiner med Luminex. Tillägg av olika renade cellpopulationer avslöjar populationernas förmåga att via co-stimulering aktivera T-celler, och även kan polarisering av svaret bedömas baserat på profil av cytokiner (Th1, Th2, Th17). Som kontroll används PBMC och jämförs med CD25+ respektive CD25- B celler.
Analys av genuttryck med realtids-PCR
RNA extraheras från lymfocyter och cDNA framställs. Expression av bland annat transkriptionsfaktorn foxp3 kan sedan kvantifieras med realtids PCR.
Preliminära resultat
16 friska kontroll-personer, 19 patienter med aktiv vaskulitsjukdom och 16 patienter med vaskulitsjukdom i remission har lämnat prover. Provtagning var 3:e månad under 18 månader pågår hos 10 patienter som fått B-lymfocyt-eliminerande behandling i form av rituximab, och detta beräknas vara färdig insamlat våren 2009.
Ett manuskript är under bearbetning av de personer som varit involverade i projektet från starten. I korthet kan nämnas att andelen CD25+ B-celler är tydligt ökad vid vaskulit i lugnt skede (remission) och skulle därför möjligen kunna användas som ett mått på sjukdomens aktivitetsgrad. Då andelen CD25+ B-celler är signifikant ökad vid vaskulit i remission, är det angeläget att ytterligare karaktärisera dessa celler i ett försök att nå ökad kunskap om de immunologiska processer som leder till respektive skyddar mot småkärlsvaskulit.

Min roll i projektet
Det finns fortfarande en stor mängd data vad gäller undergrupper bland T-celler som ännu inte är analyserade. Provinsamlingen efter rituximabbehandling pågår ännu men är inne i slutskedet. Därför återstår också att analysera hur undergrupper av B- och T-celler utvecklas efter behandling. Jag kommer att delta i detta arbete och parallellt läsa in mig på området. Jag kommer under 2010 att ägna mig åt metodutveckling enligt punkt 1 och 2. Här kommer mina erfarenheter av metoder och metodutveckling att vara till stor nytta, när denna kompetens blandas med klinisk kompetens (Per Eriksson) och cellulärimmunologisk kompetens (Jan Ernerudh).
Resurser och infrastruktur för projektet kommer att finnas på Klinisk Immunologi och Transfusionsmedicin (flödescytometri, cellodling), AIR-plattformen (där klinisk immunologisk forskning ingår och funktionella metoder finns etablerade) samt vid core facility (flödesytometrisk sortering, Luminex och PCR). Medel att driva projektet finns inom ALF/LFoU-systemet samt externa medel(Per Eriksson).

Doktorandanmäld

not checked Ja
not checked Nej

Halvtidskontroll

not checked Ja
not checked Nej

Disputerad

not checked Ja
not checked Nej

Docent

not checked Ja
checked Nej

Medarbetare/handledare

Jan Ernerudh
Professor, överläkare, Medicinska fakulteten, Diagnostikcentrum
Per Eriksson
överläkare, Reumatologiska kliniken i Östergötland
Karin Backteman
Enhetschef, Diagnostikcentrum
Christina Sandell
Klinisk immunologi och transfusionsmedicin

Forskningsmeriter

Publikationslista är inlagd/uppdaterad i ansökningssystemets personkort

checked Ja
not checked Nej

Forskningsmeriter (beskriv här eventuella tidigare forskningserfarenheter samt relevanta utbildningsmoment, utmärkelser m m)

Forskarutbildning
Disputerade vid avdelningen för cellbiologi, IKE, HU, 2009-03-20 med avhandlingen: "Deposition and Resolution of AA amyloid".

Nuvarande anställning
ST-läkare i klinisk immunologi och transfusionsmedicin sedan 2004-12-01.

Grundutbildning
Läkarexamen 1999-01-13.
Biomedicinsk forskarskola 40 poäng, 1997.

Tidigare forskningserfarenhet
Parallellt med min kliniska utbildning har jag genomfört och nyligen fullgjort min forskarutbildning vid avdelningen för cellbiologi, vid HU. Mitt avhandlingsarbete baserades på en experimentell musmodell och behandlade amyloidossjukdomar. Genom att jag själv utfört större delen av det laborativa arbetet har jag en djup och bred metodologisk kunskap. Inom ramen för min forskarutbildning har jag deltagit i undervisningen vid Hälsouniversitet bland annat som basgruppshandledare. Jag har också deltagit aktivt i ett flertal konferenser.

Nu som nydisputerad, känns det naturligt att successivt ändra forskningsinrikting och närma mig den kliniska forskningen och ett fält som ligger närmare min kliniska vardag. Vaskulitpatienterna utgör en av de större diagnosgrupperna inom klinisk immunologi.

Forskningstid

Forskningstid önskas för följande antal månader (1-3 månader kan sökas)

3

Tidplan för uttag av forskningstid

 ÅrMånadAktivitet
Forskningstid2010mars100%
Forskningstid2010april100%
Forskningstid2010maj100%
Forskningstid   
Forskningstid   

Redovisning (senast 3 månader efter att forskningstiden har utnyttjats)

Datum för redovisning

2011-03-04

Redovisning av forskningsprojekt

Tilldelad forskningstid för 2010 använde jag framförallt till litteraturstudier. Det var nödvändigt eftersom ANCA-vaskuliter var ett nytt forskningsområde för mig. Vidare behövde jag fördjupa och befästa mina kunskaper om olika subpopulationer av B- och T-celler. Dessutom var det viktigt att ”lära känna” de data som redan var insamlade och analyserade inom ramen för detta vaskulitprojekt.
Flera nya publikationer talar för att IL-17 producerande T celler (TH17) kan vara av betydelse för utvecklingen av ANCA- vaskulit. Mitt uppdrag under 2010 blev därför att sätta upp en panel för analys av cytokiner och kemokiner i plasma för att se om det fanns tecken till högre TH17-aktivitet hos patienter med aktiv ANCA-vaskulit jämfört med kontroller. Att sätta upp en multiplex cytokinpanel kräver många överväganden där såväl val av leverantör som ingående analyter kan vara av betydelse. Jag ansvarade för design och samordning av multiplex-analyserna. Plasma från patienter och kontrollpersoner fanns insamlad sedan tidigare.
De TH17 inducerade kemokinerna CXCL1 och CCL20 var högre i plasma hos gruppen med aktiv sjukdom jämfört med kontrollerna. Cytokiner är generellt svåra att mäta i plasma och någon skillnad mellan grupperna avseende cytokinnivåer kunde inte påvisas. Resultaten av studien kommer att presenteras av Dr Per Eriksson på ett vaskulitmöte i Chapel Hill,NC, USA under våren 2011.
Den tilldelade tiden för forskning togs ut under september och oktober 2010.

Decision

Decision date: 2009-06-10


Kartläggning av immunreglerande effekter efter B-cellsdepletion med rituximab vid ANCA-positiv vaskulit. | Application, from Region Östergötland
http://researchweb.org/is/en/lio/ansokan/51261